行李车承运动物、动物产品的检疫监督管理(3)

<0．01)， andALP activiq／decreased signiflcant]y(P<0．05)， but activitiesOfAMS andCHE decreased and increased insignificantly respectively(P>0．05)．AI four-month~)ld，hrds were infected＼N<出MD naturaI—真y， sertnTl proteⅡn contents decreased signincant]y(P<0．05)．S1ace dlen， dObulin content incre_a3sed insignmcantly rronth alter month．／＼lbumin content decreased signincantly(P<0．01) again at nve-rflonth-old and increased signih— cant]y at six-month~ld(P<0．01)．Total protein content decreased insignincant／y at flve-month~ld and increased s酶 nihcantly at shK．Ⅱn addition，at four-month~ld，AMS activiW increased signmcandy(P<0．01)，but activiti6OfCHE andALP both decreased signmcantly(P<0．01)．AI flve，actMtjesOf a11 the three enzymes decreased sign墒Can山(F<0．01)．At the ageOf six-month~ld，their ac6vi如s all increased，but activityOfAMS was not山gnincant and others were signincant(P<0．01)．Key wordsMDBlack chickenSerum proteinsSertanengn斓中国动物检疫2000年第17卷第7期文章编号：1005—944X(2000)07—0026—02用咽蟧疆鹦庞肠拇谵耐鹦髓毒枣罄园戴鼎震‘’汤厚宽汪银才’’程太平’’(南京农业大学牧医系南京)摘要用1对合成的特异性核苷酸片段，通过聚合酶链反应(PCR)，以鸡致病性大肠菌20个血清型菌株提取的染色体为模板进行扩增，标准阳性对照(pSLM400)及扩增到16个大小为150bp的ElNA阳性片段，其它6株及阳性对照株pEWD299未扩增到产物。斑点杂交表明，所扩增的阳性条带与标准耐热肠毒素基因(Sr)杂交后呈强阳性。关键词聚合酶链反应鸡大肠杆菌耐热肠毒素基因(Sr)肠毒素大肠杆菌(EIEC)是热带及亚热带地区旅行者腹泻的主要病原，主要通过产生肠毒素引起人类发病，如热敏肠毒素(LT)和耐热肠毒素(S盯)是最主要的两种毒素u，21。产L丁及Sr的菌株可引起哺乳仔猪腹泻、脱水、死亡，但对鸡的报道较少：’乙检测Sr有助于该病诊断或流行病学调查。通常检测Sr只能通过乳鼠试验，方法成本高、费时费力，41。近年来，有人通过核酸杂交技术发现：4l，人类EIECSr基因与猪和鸡大肠杆菌染色体杂交后具有很高的阳性率，引起国内一些研究人畜共患病学者的关注。本研究拟从PCR扩增的角度，选择扩增ST基因的特异性引物。以最常见的20个不同血清型的鸡致病性大肠杆菌染色体为模板，进行P(R扩增与分析，确定鸡大肠杆菌Sr基因的分布，为研究人大肠杆菌性腹泻提供资料。 l材料与方法1．1细菌菌株E．coli20个血清型菌株(表1)分离自患有鸡大肠菌病的鸡体，经中国兽药监察所鉴定，农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室保存。E．coliK121'-IBl01(pEWD299LT+)及E．coliK12HBl01(pSt．M1400SI'+)均由解放军农牧大学周志江副教授惠增。1．2主要试剂 dNTPTaq酶等购自华美生物工程公司。1)通讯地址：南京孝陵区，江苏农科院畜牧兽医研究所)江汉油田畜牧研究所潜江．3Sr基因扩增引物的合成选择文酬11提供的引物进行扩增，引物15’AAA3’，引物25’AO＼YCGOO》：OGA9、A。ICOCrA：Q订3’由中国科学院上海植物生理研究所协助合成。目的基因为Sr，基因片段(150bp)。亚．4细菌染色体提取按文献‘‘’略加改动。单菌落接种5mLLB培养液，置37C培养过夜，离心沉淀，用适量0．IMNaCI—0．1MEDTA2E缓冲液。1．5基因扩增反应体积为100弘乙模板I~NAl5昭，引物400昭，IVy,C120．2mM。预变性后加5UTaq酶，温度转换模式为94C60s—55C60s—72℃60s，共30个循环。扩增后用2％琼脂糖，电泳鉴定扩增产物。1‘6核酸针斑点杂交试验SI'地高辛基因探针由农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室研制并提供，按文献‘’提供的方法将表120个E．coli菌株的PCR反应结果菌株号血清型菌株PCR菌株号血清型菌株PCR l01H05+12O关M‘o+202HG，+1301扎Lcb+309PC2+GN，404HJ，NS9+5011MⅡo16O辎Q45c+6030TX5h+ZX2+?O捣XSe+HR2+8050CⅡ，，+1901，4HJ20+9060B邓+20O'5X，+ⅡOU78L7+2l pEWD299儿()115Q2022 pSLM400+(pH8．0)含一定量溶菌酶溶液悬浮，37℃孵育15 min，然后置液氮上方速冻，后65C融化。于细菌悬浮液中加入5倍量的0．IMNaCl—0．IMTris(pH8．0)—0．1％SDS溶液。重复冻融一次。用等体积的饱和酚、酚：氯仿及氯仿各抽提1次。上清用2体积的无水乙醇沉淀，g离心，再用70％乙醇洗涤，沉淀溶解于10t~L'IE缓冲液。再经0．8％琼脂糖凝胶电泳，低融点琼脂糖回收，得到纯化的染色体模板。将其溶于适量的上述PCR扩增阳性的产物与Sr地高辛核酸探针进行斑点杂交试验。2结果与分析2．1PCR扩增结果20个不同血清型菌株有16株扩增到阳性条带， pSKA4400阳性对照株也扩增到阳性条带，另有4株鸡大肠杆菌及pEWD299阴性对照未扩增到阳性产物(表1)。由结果可以看出，阳性对照和鸡大肠杆菌样品大多数都能扩增到阳性产物，而阳性对照扩增出阳性条带，说明PCR扩增产物很可能就文章编号：1005—944X(2000)07—0027—03阿卡斑(赤羽病)病毒的分离与初步鉴定李其平周立桥姚龙涛¨蔡玉书¨陈向前卫龙兴¨李昌琳王新丁江李金萍李业红’’张雪莲’’(农业部动物检疫所青岛)摘要1998年7月—8月从上海地区采集的蚊、蠓等标本中分离到12株病毒，其中有3株电镜观察病毒近似球形，有囊膜，病毒对乙醚、氯仿和胰蛋白酶敏感，对酸、热不敏感，抵抗5—氟脱氧尿苷。经血清—细胞和动物中和试验鉴定，该三株病毒均能被AKV病毒高效价免疫血清中和，其余9株病毒未被AKV高价免疫血清中和，经初步鉴定证实上述三株病毒为阿卡斑病毒(Akabane vires，AKV)。阿卡斑病毒在我国的分离尚属首次报道，具有重要的动物流行病学意义。关键词阿卡斑病毒蚊上海近年，我国上海、广州、福建等地各牛场常发现有不明原因的流产、早产、死胎、新生胎儿关节弯曲及积水性无脑症等。1997年上海地区部分奶牛场再次暴发了以妊娠母1)上海市奉贤县畜牧兽医站2)河北张家口农业高等专科学校动物医学系牛异常流产为典型特征的一种传染病，异常流产率在10％一15％，流产胎儿以死胎、畸形胎居多，关节弯曲，当地兽医部门用AKV抗原做HA试验检测流产母牛血清抗体和流产胎儿(未吃过初乳)血清抗体，阳性率达85％，由此推断此病可能是阿卡斑(赤羽病)病毒感染所致。由于当地条件所限，当时未能进行病毒分离工作。1998年我们与上海奉贤县畜牧兽医站协作，从当地捕获蚊、蠓进行病毒分离与鉴定，现报告如下。1材料与方法是ST，基因片段。2．2PCR产物的鉴定经地高辛标记的核酸探针进行斑点杂交试验，所扩增的产物均与探针有强阳性杂交反应，而阴性对照株与探针杂交阴性。证明PCR产物与SSr基因具有同派陆，根据以上结果，我们认为PCR产物即为SI'l的基因片段。3讨论与小结鸡致病性大肠杆菌产物毒素的特性及其在流行病学意义在国内外报道很少，Emeng等，’’研究了鸡大肠杆菌致病因子的部分特性，发现鸡分离株中22．5％的菌株，火鸡分离株中11．4％的菌株仅产生对Vero细胞毒性的LT，但均不产生SSr。我国学者冉雪琴等’’运用IK3R扩增到3株鸡源大肠杆菌LT基因。赖平安、周志江等『d‘运用生物素标记的核酸探针进行杂交试验发现分离自鸡的大肠杆菌中，14株雏鸡分离菌ST阳性率为93％，9株中鸡分离株SSr阳性率为100％，5株蛋鸡分离菌ST阳性率为60％。这些研究结果表明，ST基因不仅在于群类大肠杆菌，而且分布还较广。我们运用PCR技术检测SSr基因的结果说明ST基因方法分布于绝大多数不同血清型的致病性大肠杆菌中(占70％)对鸡大肠杆菌病的发生起着主要作用，由于大肠杆菌鸡病因子很多，如菌毛、气菌素、大肠杆菌素等。因此，要评价ST在人与鸡大肠杆菌意义还应结合其它试验加以研究。参考文献1许崇波，卫广森．中国兽医学报，1997，(2)：112—1142冉雪琴，王嘉福，吴用军．西南农业学报，1997，133许崇波，冯书章．中国兽医杂志，1993，(3)：47—484赖平安，周志江，王占贺等．中国兽医科技，1995，(3)：16—175萨姆布鲁克著，金冬雁等译．分子克隆实验指南．第2版．北京：科学出版社，1995,672—6806CleggS．Infect llrllRln，1985，48：275—2787EmeryDA．AvianDiseaxs，1992，36：504—506DetectionOfSTGeneOfAvianEscherichia coli byPolymeraseChainReaction(PCR)DaiDing-zheng，TanHou-kuan，WangYin-cai，ChengTai-ping(NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing)AbstractBasedOn the publishedST gene nucleotide sequences frcrn humanEseherichia coli， a pairOf primers were desighed and synthesized，16 positive150 bp products were generated by polymerase chain reaction(PCR)frcrn20c1)Dcn)0sOml samplesOf different stereotypeEschefichia coli strains．Hybridization results show~that these150 bp positive products were identical t()the referenceE．coliST gene as detected by dot-blot hybridization．KeyWordsPCREseheriehia eoliS；I，gene中国动物检疫2000年第17卷第7期1．1标本采集1998年7月—8月，用挥网、畜帐诱捕及电动吸蚊器等法从上海奉贤县境内的十余个乡、镇、畜牧场，江、河、渠、池塘、稻田等周围不同生态环境中共采集到蚊、蠓余只，按病毒分离标本常规处理现场进行大体分类、分组并立即冻入液氮内保存备检。1．2病毒分离1．2．1细胞猴肾细胞克隆株(SVP)为本所保存复苏株，白纹伊蚊细胞(C6／36)和绿猴肾细胞(Vero)株由中国预防医学科学院病毒学研究所惠赠，乳地鼠肾细胞(BHK-21)株由上海奉贤县畜牧兽医站惠赠，猪肺泡细胞(Marc)株由大连动植物检疫局惠赠，牛肾原代细胞(BK)株本所制备。Ⅱ．2．2实验动物3日龄一5日龄乳小白鼠和2周龄一3周龄小白鼠均由上海市实验动物中心和青岛市实验动物中心提供。1．2．3标本的实验前处理和细胞、动物感染试验等均按本所常规方法进行tl—3l。1．3病毒鉴定1．3．1生物学特性病毒对不同日龄乳小白鼠、不同周龄小白鼠及多种其他动物细胞(SVP、Vero、BHK-21、C6／36、Marc及BK)致病作用、空斑形成和在动物体内的分布情况等，均按中国预防医学科学院病毒学研究所和美国C．D．C等常规方法进行Id“21。1．3．2理化特性病毒核酸型及对酸、热、乙醚、氯仿、胰蛋白酶等敏感性试验，按常规操作‘d“o)。1．3．3形态学特性磷钨酸负染和超薄切片法均按电镜技术常规进行[8…121。1．3．4血清学特性AKV高免血清由澳大利亚惠赠和本所用澳大利亚惠赠的国际标准AKV病毒株免疫山羊制备。参考病毒株：布尼雅病毒科布尼安病毒(Bun)、雪鞋兔(SSH)、克里米亚出血热(CHF)及赤羽病(AKV)病毒，披膜病毒科(。110gaviridae)甲病毒属(Alphavims)基孔肯雅(CHIK)、东马(EF．E)、盖塔(GE了)、马雅罗(MAY)、罗斯河(RR)、萨基雅马(SAG)、西丫刁利森(Sf；)、辛德毕斯(SIN)、委马(VEE)、及西马(WEE)病毒，黄病毒科(Flaviviridae)黄热(YF-17D)、波瓦生(pow)、库宁(KUN)、登革(DEN)、森脑(RSSE-CC~)、西尼罗(WN)及乙脑(A2、P3、SA-14等)病毒，呼肠孤病毒科(Reoviridae)蓝舌(B山)、新环状(VSV)、新疆(XJ)、新疆(XJ9068)及云南(ANN)病毒等免疫血清及免疫腹水等均由美国C．D．C、中国预防医学科学院病毒所、卫生部药品及生物制品检定所、流行病学研究所、中国军事医学科学院流行病学和微生物学研究所(五所)等提供及北京病毒所和新疆流行病学研究所制备。动物中和、细胞中和、空斑中和试验及对鸡、鸭、鹅、鸽、羊、猪、牛、马等红细胞凝集反应试验等均按美国C．D．C和中国预防医学科学院病毒所等常规，：—1：’试验进行。2结果2．1病毒分离用SVP、Vero、BHK-21、C6／36、MARC等传代细胞和BK原代细胞及4日龄一5日龄乳小白鼠和2周龄一3周龄小白鼠等从上海采集的余只蚊子体内分离到12株病毒，即、、、、、、、、、、和。2．2病毒鉴定2．2．1细咆敏感范围和病变特点及细胞半数感染剂量(7CIDSO)的测定12株病毒均能引起BHK、Vero和SVP细胞的圆缩、融合、脱落、破碎及颗粒增多等。12株病毒在上述三种细胞内的增殖滴度为6．2—9．8lg7ClD9；其中9株病毒能引起上述三种传代细胞病变(CPE)外，尚能引起C6／36细胞病变；3株病毒(、和)不引起C6／36传代细胞病变；12株病毒均不引起Marc传代细胞和BK原代细胞病变；但不引起上述三种细胞病变的病毒均能在其不敏感的细胞内增殖。2．2．2动物感染试验及半数致死量(1丁)50)的测定用分离的12株病毒以脑内感染3日龄一5日龄乳小白鼠和2周龄一3周龄小白鼠，均于3d一6d内出现散群、离乳、竖毛、兴奋(惊恐不安、跳跃等)，以后逐渐下降而转呈抑制状态，肢体麻痹(以后肢最为明显)、活动受限、萎靡、震颤，颈、背强直及死亡等。2．2，3血清学特性用AKV高免血清对分离的12株病毒分别用培养成单层的SVP、Vero、BHK、C6／36、等4种细胞做血清一细胞微量中和试验，进行毒株筛选，结果发现12株病毒中有3株能被AKV高免血清所中和，2株可疑，其余7株不与AKV高免血清发生反应。血清一动物(2周龄小白鼠)中和试验表明3株(、、)病毒的中和滴度分别为蝗’o—d·Q、驴‘o—d．，。和垣’o—3w，中和指数分别为、和9772。2．2．4形态学鉴定将前述3株病毒感染SVP、BHK和Vero细胞，到3d一4d，当70％一80％细胞病变时收毒，置—30C反复冻融3次一4次后收置灭菌离心管3000r／min离心15min一20min，去除沉淀(细胞碎片)取上清分别置灭菌高速离心管，r／min离心lh，取沉淀，用少许(0．5mL左右)上清悬浮后做负染标本，同时三株病毒分别感染3周龄／j、白鼠，4d一6d／j、白鼠发病，在小白鼠濒死前无菌取鼠脑置戊二醛液中固定做超薄切片标本；电镜观察可见许多似球形、有包膜、颗粒直径为(100±30)Bin大小的病毒颗粒。2．2．5病毒血凝特性鉴定用鸡、鸭、鹅和鸽红细胞与这三株病毒做细胞凝集试验，结果三株病毒能与鸭、鹅和鸽的红细胞发生凝集反O-IINAANIMAL

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